Elektroforez, bir çözeltideki yüklerin zıt elektrotlara doğru aktığı kimyasal bir işlemdir. 1930'larda İsveçli biyofizikçi Arne Tisselius, kan proteinlerini incelerken elektroforezi geliştirdi. 1948'de Arne Tisselius, elektroforez tekniğine yaptığı katkılardan dolayı Kimyada Yeni Ödül'e layık görüldü.
Jel elektroforezi DNA, RNA veya protein moleküllerini elektrik yüküne veya boyutlarına göre ayırmak için kullanılan laboratuvar yöntemlerinden biridir.
Jel Elektroforezi Nasıl Çalışır?
Elektroforezin ardındaki prensip, çoğu biyomolekülün iyonize edilebilir fonksiyonel gruplara sahip yüklü parçacıklar olarak var olduğu gözlemidir. pH'a bağlı olarak, biyomoleküller içeren bir çözelti pozitif veya negatif yüklü iyonlara sahip olacaktır.
Yüklü moleküller bir elektrik alanına yerleştirildiğinde, pozitif veya negatif kutba zıt yönde hareket ederler. Çözeltideki her parçacığın kütlesine ve net yüküne bağlı olarak, iyonize biyomoleküller bir elektrik alanına maruz kaldıklarında farklı hızlarda göç ederler.
Nükleik asitler gibi negatif yüklü parçacıklar anoda doğru çekilirken, pozitif yüklü parçacıklar katoda doğru hareket eder. Hız ve yöndeki değişiklikler nedeniyle, her yüklü parçacık kendine özgü özellikleri tarafından belirlenen bir desende göç edecek ve benzer özelliklere sahip biyomoleküllerin ayrılmasına izin verecektir.
Tipleri Gel Elektroforez
Bunlar ayrıca doğal ve denatüre olarak sınıflandırılır; burada RNA veya protein doğal jel elektroforezinde jelden geçerken doğal yapısını korur. Buna karşılık, denatüre edici jel elektroforezinde RNA veya protein, jel elektroforezi öncesinde veya sırasında doğrusal bir yapıya indirgenir. Bu indirgeme, RNA veya protein molekülü içindeki bağları kesen ve ikincil yapıların oluşumuna yol açan bir indirgeyici maddenin numuneye, jele ve/veya tampona eklenmesiyle gerçekleştirilir.
kağıt jel elektroforezi
Klinik ortamlarda serum ve diğer vücut sıvılarının incelenmesinde kullanılır.
Opak ve toksik olmayan
uygun depolama
protein adsorpsiyonu
Zayıf iletkenlik
arka plan boyama
Selülozun OH grupları proteinlere bağlanarak elektroforetik hareketi yavaşlatır, bu da bant kuyruklanmasına ve zayıf çözünürlüğe yol açar.
Agaroz jel elektroforezi
Agaroz konsantrasyonu elektroforezin çözünürlüğünü belirler.
100 baz çiftinden 20 kilobaz çiftine kadar olan DNA parçalarının ayrılmasına uygundur.
Ayrıca proteinlerin elektroforetik ayrımında da kullanılır.
Düşük konsantrasyonda agar jel kullanıldığında, amfoterik molekülleri izoelektrik odaklama olarak bilinen izoelektrik noktalarına göre ayırmak için kullanılabilir.
Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)
%3-30’a kadar konsantrasyonda kullanılır (pH aralığı: 4-9.0): protein ayrımı DNA ayrımından daha yüksek konsantrasyon gerektirir, tersi de geçerlidir.
Daha yüksek güvenilirlik ve hassas gözeneklilik.
DNA'nın moleküler ağırlığının hesaplanması, DNA dizilenmesi, DNA saflığının incelenmesi, rekombinant DNA moleküllerinin analizi ve RNA moleküllerinin ayrılması, RNA'nın moleküler ağırlığının ölçülmesinde uygulamaları görülmektedir.
Darbeli alan jel elektroforezi (PFGE)
Agar jelde DNA ayrımı, elektrotlar arasındaki elektrik alanının yönünün ve şiddetinin değiştirilmesiyle gerçekleştirilir.
Bu teknik kullanılarak çok sayıda megabaz içeren yüksek molekül ağırlıklı DNA'lar veya hatta tüm kromozomlar ayrılabilir.
PFGE, verimli bir şekilde tekrarlanabilir, hassas sonuçlar ürettiği için birçok alanda kullanılmaktadır.
Gıdalarda bulunan patojenlerin moleküler biyolojisi, fermantasyon sürecinde kullanılan organizmaların genetik stabilitesinin izlenmesi, kromozom yeniden düzenleme tespiti, RFLP, DNA parmak izi gibi haritalama uygulamaları, hastane salgınları durumunda bağlantılı suşların tanımlanması vb. konulardaki çalışmalarda uygulanmaktadır.
Sodyum dodeasil sülfat-Poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) başlangıçta İngiliz mucidi UK Laemmli'nin adıyla Laemmli Yöntemi olarak adlandırıldı.
Üstteki istifleme jeli, pH'ı 6.8 olan daha büyük gözeneklere sahipken, alt ayırıcı jel, pH'ı 8 olan daha küçük gözeneklere sahiptir.
Sodyum dodeasil sülfat (SDS, sodyum lauril sülfat olarak da bilinir) ve poliakrilamid jel kullanımı sayesinde yapı ve yükün etkisinin büyük oranda ortadan kaldırıldığı SDS-PAGE'de proteinler polipeptit zincir uzunluğuna göre ayrıştırılır.
Örnek tamponundaki deterjan olan SDS ve bazı indirgeyici kimyasallar, proteinlerin disülfit bağlarını kopararak üçüncül yapılarına zarar vermek için birlikte çalışırlar.
Proteinin molekül ağırlığını hesaplamak ve protein örneklerinin saf olup olmadığını belirlemek için kullanılır.
İzoelektrik nokta ve İzoelektrik odaklama (İEF)
İzoelektrik nokta olarak bilinen pH seviyesi, proteinlerin net yüke (pI) sahip olmadığı seviyedir. Proteinler, izoelektrik odaklama (IEF) olarak bilinen yüksek çözünürlüklü yaklaşım kullanılarak sürekli bir pH gradyanı içinde izoelektrik noktalarına göre ayrılır. Sadece 0.01 pH biriminde pI farkı olan bileşikler, mükemmel ayırma gücü sayesinde ayrılabilir.
İzoenzimleri ayırt etmek, proteinleri fraksiyonlamak ve tüm amfoterik maddeleri ayırmak için kullanılır.
2D jel elektroforezi
Karmaşık protein karışımlarının analizinde kullanılır ve 2DGel, IEF ve SDS-PAGE prosedürlerinin bir hibriti olarak oluşturulmuştur.
IEF, proteini ilk adımda yüklerine göre, ikinci adımda ise kütlesine göre ayırır.
SDS işlemi, IEF jelindeki ayrılmış proteini negatif yüklü hale getirir ve elektroforez, jelin SDS-PAGE jelinin içine yatay olarak yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir.
Sonuç olarak pI üzerinde yoğunlaşan proteinler molekül ağırlıklarına göre ayrılır.
İmmüno-elektroforez (Roket Elektroforezi)
İmmün elektroforez (İEP) işleminde, öncelikle yarı katı besiyerinde elektroforez ile protein antijen ayrıştırılır, ardından antiseruma karşı immünodifüzyon yapılarak presipitin oluşturulur.
Ölçülecek test antijenine tamamlayıcı uygun antikorlar erimiş bir agar çözeltisinde çözülür ve yatay bir plakaya yerleştirilir. Antijenler jelde açılan kuyulara enjekte edilir. Ag, alkali pH'ta negatif bir yük alır, anot yönünde hareket eder, Ag-Ab kompleksini oluşturmak için Ab ile etkileşime girer ve çökelir. İmmüno-çökeltiler daha sonra jel CBB gibi uygun bir boya ile boyandığında roketler gibi arklar şeklinde görünecektir.
Uygulama Gel Elektroforez
DNA parmak izi, suç mahalli incelemesi ve babalık testi için DNA parçalarının izole edilmesini sağlar.
Sağlık ve hastalıkla ilişkili genetik varyantları ve proteinleri tespit edin.
Bilimsel amaçlarla nükleik asit ve proteinlerin tespiti ve saflaştırılmasında kullanılır.
Kan, diğer dokular veya gıda gibi kaynaklarda patojenlerin bulunmasına yardımcı olur.
Genellikle kütle spektrometrisi veya DNA dizilemesi kullanılarak daha ayrıntılı incelenen proteinlerin veya nükleik asitlerin tanımlanmasına ve saflaştırılmasına yardımcı olur.
Makromoleküllerin analizinde ve evrim çalışmalarında blotlama yöntemlerinde kullanılır.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) sonuçlarının değerlendirilmesinde yardımcı olur.
Elektroforez, hem aşı geliştirme hem de üretim aşamalarında fayda sağlıyor.
Tür ve evrimsel ilişkileri ayırt etmek için taksonomik-DNA analizi yapıldı.
Avantajları Gel Elektroforez
- Ekonomik.
- Benzer sonuçlar arasında doğrudan bağlantılar kurun
- uygulaması kolay
- Her türlü delilden DNA testi yapılabilir.
- mükemmel çözünürlük
- Çeşitli gözenek boyutlarında mevcuttur.
- Geniş bir pH, sıcaklık ve iyonik güç aralığında kararlıdır
- yarı saydam
- kimyasal olarak etkisiz
- Elektronötralite ve hidrofilisite
