A floresan mikroskop mikroskopik inceleme için floresan üretmek üzere incelenen nesneyi belirli bir dalga boyundaki ışıkla ışınlayan, 100 yılı aşkın bir geçmişe sahip mikroskobik optik gözlem teknolojisidir. Son yıllarda, immünofloresansın tıbbi araştırma ve teşhis alanında yaygın olarak uygulanması, FISH ve yeşil floresan protein (GFP) teknolojisinin genomik ve proteomik araştırmalarda kullanılması ve mikrofotoğrafçılık ve dijital CCD görüntüleme teknolojisinin yardımcı tahriki nedeniyle, floresan mikroskopları daha yeni uygulama değerine ve canlılığa sahiptir.
Floresan Mikroskobunun Prensibi
Floresan mikroskopu "aktinik floresan" görüntüleme kullanır. Seçilen uyarım dalga boyu çıplak gözle görülemeyen yakın morötesi bölgede (320-400nm) ise, floresan emisyon spektrumu da sıradan ışık aynalı ışık kaynaklarının ortalama dalga boyundan daha kısadır ve optik çözünürlük artar.
Floresan Mikroskobunun Uygulama Noktaları
Floresan mikroskop uygulaması – Ön kontrol ve ayarlama
(1) Her floresan gözleminden önce, floresan mikroskop cihazı rutin olarak filament hizalamasını, optik yol odağını, diyafram açıklığını ve alan diyaframı ayarlarını kontrol etmelidir.
(2) Dönüştürücüye gerekli floresan uyarım/emisyon filtre tertibatının takılı olup olmadığını ve objektif merceğinin uygun şekilde yapılandırılıp yapılandırılmadığını kontrol edin ve ardından objektif merceğinin ön merceğindeki yağı ve tozu temizleyin.
(3) İletilen ışığın faz kontrastı gözlemi aynı anda yapılıyorsa, kondansatörün merkezi ile objektif merceğin karşısındaki faz kontrast halkasının birleşmesinin kontrol edilmesi gerekir.
(4) Örnek taşıyıcının (slayt camı, kapak camı ve diğer kaplar) sıvı veya tozla kaplı olup olmadığını ve kalınlığın objektif merceğin kalibre edilmiş çalışma mesafesi aralığında olup olmadığını kontrol edin. Dilimlenmiş örnek çok kalın olmamalı, tercihen ≤10 μm olmalıdır.
(5) Aydınlatma kaynağı ultraviyole ışınlar içerdiğinden, ultraviyole ışınlarının retinaya zarar vermesini önlemek için sahnenin ön tarafına kahverengi bir ışık kalkanı plakası yerleştirilir.
(6) Gerilim dengesizliği, yüksek basınçlı cıva lambalarının kullanım ömrünü azaltacaktır ve ışık kaynağı güç kaynağına bir gerilim dengeleyici eklemek en iyisidir.
(7) Cıva lambasının ömrünü uzatmak için, açıldıktan 15 dakika sonra kapatılabilir. Cıva lambasının floresan gücü kapatıldıktan sonra, cıva buharının soğuması ve orijinal durumuna dönmesi için en az 10 dakika beklemesi gerekir. Aksi takdirde, lambanın ömrü etkilenecektir.
Floresan mikroskop uygulaması – Floresan ayna gözlemi
(1) Floresan ışık kaynağı yaklaşık 5-10 dakika açıldıktan sonra, uyarım ışığının yoğunluğu sabit olma eğilimindedir ve numune gözlem için yüklenir. Odaklanma ve nesneleri arama işlemi sırasında aşırı uyarım ışığının neden olduğu numunenin floresan sönümlenmesini önlemek için, önce uzaklaştırmak en iyisidir. Floresan aydınlatıcının diyafram açıklığı veya ND filtresi, uyarım ışığını orta yoğunluğa ayarlamak için eklenir ve numune aşaması düzenli olarak hareket ettirilir. Ayna görüntüsü doğrulandıktan sonra, çekim ve kayıt için en iyi floresan durumuna ayarlanır.
(2) Zayıf görüntü kalitesi için ayarlamalar. Örnek hazırlama faktörlerine ek olarak, yapılabilecek gerekli ayarlamalar şunlardır:
① Görüntüleme optik yolunda DIC aksesuarları, ND filtreleri vb. gibi ışık kalkanı veya ışık sınırlayıcı cihazları hariç tutun.
②Floresan aydınlatıcının alıcı odak ve diyafram boyutunu yeniden ayarlayın.
③ Objektif lens kapsama farkı düzeltme halkasını dikkatlice ayarlayın.
④Floresan uyarım/emisyon bileşenlerinin etiketli floresan pigmentlerine karşılık gelip gelmediğini tekrar kontrol edin.
(3) Geçici olarak gözlem yapılmadığında, uyarım ışık yolu engellenmelidir.
Floresan mikroskop uygulaması – Floresan fotoğrafçılığı
①Çıplak gözle gözlemlenen floresan ayna görüntüsünün parlaklığı sıradan parlak bir alanın parlaklığına neredeyse aynı olsa da, gerçek pozlama süresi birkaç kat hatta onlarca kat artacağından, ISO200 (24DIN), ISO400 (27DIN) gibi hızlı ışığa duyarlı film kullanılmalıdır.
② Poz telafisi ayarını, ölçüm alanındaki floresan nesne görüntüsünün dağılım oranına ve ayna görüntüsünün açıklığına ve koyuluğuna göre ayarlayın. Prensip olarak, koyu bir arka plana sahip floresan görüntünün parlak ve canlı bir fotoğraf efekti elde etmek için telafi uygun şekilde artırılmalıdır.
③ Aydınlatmalı retikül vizörü yoksa, odak ayarı için daha parlak bir floresan alanı seçebilirsiniz.
④ Noktasal floresan nesne görüntüleri veya belirli bir noktayı yakalamak için uygun bir nokta ölçüm modu seçebilirsiniz.
⑤ Aynı koşullar altında çekilmesi gereken dağınık nokta benzeri floresan nesne görüntüleri için noktasal ölçüm ve otomatik kilitlemeyi kullanarak çekim yapabilirsiniz.
⑥Pozlama işlemi sırasında her türlü titreşimden kaçınılmalı, mümkünse titreşim önleyici bir masa bulundurulmalıdır.
(2) Dijital CCD kamera görüntü edinimi
① Optik arayüzün ara büyütmesi, CCD çipinin boyutuyla makul ölçüde uyumlu olmalıdır.
②Uygun floresan çekim modunu kullanın, arka plan çıkarma (Background Subtraction) işleme koşullarını keşfedin ve Binning, Gain, Gamma ve diğer parametreleri ayna görüntüsüne göre ayarlayın.
③CCD çipinin yüksek hassasiyeti nedeniyle, floresan ayna görüntüsü çok parlaksa, daha iyi kontrastlı bir görüntü elde etmek için, floresan aydınlatıcının diyafram açıklığı uygun şekilde azaltılabilir veya özellikle güçlü floresan parıltısının ayrıntılar söz konusu olduğunda örneği etkilediği durumlarda bir ND filtresi eklenebilir.
Gerçekte, daha iyi floresan görüntü çekim kalitesi elde etmek için yukarıda belirtilen ayarlama mekanizmasının kapsamlı bir şekilde kullanılması ve koşulların tekrar tekrar incelenmesi ve optimize edilmesi gerekmektedir.
