Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) genetik ve biyoteknolojide devrim yaratan bir moleküler biyoloji tekniğidir. Araştırmacıların DNA'nın belirli kısımlarını çoğaltmasını sağlayarak genetik test ve adli tıptan hastalık teşhisine ve DNA dizilemesine kadar çeşitli uygulamalara olanak tanır. Bu makalede, PCR nasıl çalışır?.
PCR'nin Temel Çalışma Prensibi
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), DNA'nın belirli bir bölümünü çoğaltmak için tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngülerini kullanan bir laboratuvar prosedürüdür. PCR, doğal DNA replikasyonu prensiplerine dayanır, ancak DNA'yı kontrollü ve hedefli bir şekilde çoğaltır.
PCR'nin 3 Temel Çalışma Adımı
Denatürasyon, tavlama ve uzatma PCR'deki üç temel işlemdir. Her adım, hedef DNA dizisinin doğru ve verimli bir şekilde çoğaltılmasını sağlamak için titizlikle planlanır.
1. Denatürasyon
Bu, PCR sürecinin ilk adımıdır. Hedef DNA dizisi içeren DNA örneği yüksek bir sıcaklığa, tipik olarak 94-98 santigrat derece (201-208 Fahrenheit derece) kadar ısıtılır. Denatürasyon, DNA çift sarmalı çözülüp yüksek sıcaklık nedeniyle iki tek zincire ayrıldığında meydana gelir. Bu ayrılma, hedef DNA dizisine erişim sağlar ve amplifikasyon için başlangıç noktası görevi görür.
2. Tavlama
Denatürasyondan sonra sıcaklık yaklaşık 50-65 santigrat dereceye (122-149 Fahrenheit) düşürülür. Primer olarak bilinen kısa DNA dizileri bu sıcaklıkta tek zincirli DNA üzerindeki tamamlayıcı dizilerine bağlanır. Primerler hedef DNA dizisine özgü olacak şekilde tasarlanır ve yalnızca istenen yere bağlanır. Primerler DNA sentezi için başlangıç noktası görevi görür ve çoğaltılacak bölgeyi tanımlamaya yardımcı olur. Bu adıma tavlama denir.
3. Uzatma/Ekstraksiyon
Primerler hedef DNA dizisine bağlandığında sıcaklık yaklaşık 72 santigrat dereceye (162 Fahrenheit) çıkar. Isıya dayanıklı bir DNA polimeraz enzimi, primerlere nükleotidler ekleyerek ve bunları bölünmüş DNA dizileri boyunca tamamlayıcı bir şekilde uzatarak bu sıcaklıkta yeni bir DNA dizisi sentezler. Yeni bir DNA dizisi yapmak için, DNA polimeraz şablon dizisini "okur" ve tamamlayıcı nükleotidleri entegre eder. Buna uzatma veya uzama denir. Bu fazın sonunda hedef DNA dizisinin iki kopyası üretilmiştir.
PCR Döngüleri ve Amplifikasyonu
PCR döngüleri, belirli bir hedef DNA dizisini çoğaltmak için polimeraz zincir reaksiyonunda (PCR) tekrarlanan işlemlerdir (denatürasyon, tavlama ve uzatma).
Amplifikasyon prosedürü, amplifikasyonu yapılacak hedef DNA dizisini içeren bir DNA örneği ile başlar. DNA ilk döngüde denatüre olur ve iki ayrı tek zincir oluşur. Kısa, benzersiz DNA dizileri olan primerler, her bir zincirdeki tamamlayıcı dizilerine bağlanır.
Uzatma adımında DNA polimeraz, primerlere nükleotidler ekleyerek ve bunları bölünmüş DNA zincirleri boyunca uzatarak yeni DNA zincirleri sentezler. İlk döngünün sonunda hedef DNA dizisinin iki kopyası üretildi.
Sonraki turlarda, taze üretilen DNA zincirleri, devam eden çoğaltım için şablon görevi görür. Denatürasyon adımı çift sarmallı DNA'yı tekrar tek sarmallara ayırır ve primerler hedef DNA bölgelerine bağlanır. DNA polimeraz daha sonra primerleri uzatarak yeni DNA zincirleri sentezler.
Denatürasyon fazı, çift sarmallı DNA'yı tekrar tek sarmallı hale getirir, ardından primerler hedef DNA dizilerine bağlanır. Primerler daha sonra DNA polimeraz tarafından uzatılır ve ek DNA zincirlerinin oluşumuyla sonuçlanır.
DNA miktarı her döngüde yaklaşık olarak iki katına çıkar. Örneğin, amplifikasyonun başlangıcında 10 hedef DNA molekülü mevcutsa ve 20 döngü tamamlanırsa, amplifikasyonun sonunda hedef DNA'nın yaklaşık 10 x 220 (bir milyondan fazla) kopyası olacaktır.
PCR amplifikasyonu moleküler biyolojide yararlı bir yöntemdir çünkü araştırmacıların az miktarda başlangıç materyalinden büyük miktarda hedef DNA dizisi çıkarmasına olanak tanır. Daha sonra çoğaltılan DNA incelenebilir, dizilenebilir veya genetik test, teşhis, adli tıp ve araştırma gibi çeşitli alt akış uygulamalarında kullanılabilir.
PCR'nin Varyasyonları ve Modifikasyonları
Bireysel araştırma hedeflerine ve uygulamalara uyum sağlamak için PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) çok sayıda değişikliğe ve uyarlamaya tabi tutulmuştur.
Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR)
Bu yöntem, RNA moleküllerinin ters transkriptaz enzimi tarafından tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürülmesinden sonra çoğaltılması için kullanılır. RT-PCR, gen ekspresyonunu, RNA virüslerini ve RNA bazlı aktiviteleri incelemek için gereklidir.
Gerçek Zamanlı PCR
Gerçek zamanlı PCR, kantitatif PCR (qPCR) olarak da bilinir, amplifikasyon süreci sırasında DNA veya RNA'yı tespit eder ve miktarını belirler. Oluşturulan DNA miktarına orantılı sinyaller yayan floresan boyalar veya problar kullanır. Gerçek zamanlı PCR, amplifikasyonun hassas bir şekilde kantifikasyonunu ve gerçek zamanlı izlenmesini sağlayarak PCR sonrası analiz ihtiyacını ortadan kaldırır.
İç içe PCR
Yuvalanmış PCR'de iki set primer kullanılır. İlk set DNA'nın daha geniş bir bölgesini çoğaltırken, ikinci set ilk çoğaltılmış sonucun içindeki daha küçük bir bölgeye odaklanır. Yuvalanmış PCR, özellikle düşük miktarda hedef DNA veya karmaşık DNA karışımları içeren senaryolarda özgüllüğü ve duyarlılığı artırır.
multipleks PCR
Multiplex PCR, aynı işlemde çok sayıda hedef DNA dizisinin çoğaltılmasına olanak tanır. Her benzersiz hedef DNA dizisi, farklı primer setleri kullanılarak çoğaltılabilir ve bu da birden fazla genin veya genetik varyantın eş zamanlı olarak incelenmesine olanak tanır. Multiplex PCR, genotip belirleme, hastalık tespiti ve adli analiz dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda faydalıdır.
Sıcak Başlatma PCR
Sıcak Başlangıç PCR, spesifik olmayan amplifikasyonu önlemek ve reaksiyon özgüllüğünü iyileştirmek için değişiklikleri entegre eder. Başlangıç denatürasyon fazına kadar inaktif olan spesifik DNA polimeraz veya modifiye primerler kullanmayı gerektirir, bu da arka plan gürültüsünü azaltır ve amplifikasyon verimliliğini iyileştirir.
Dijital PCR (dPCR)
PCR reaksiyonu, her biri eser miktarda DNA şablonu içeren binlerce ayrı reaksiyona bölünür. dPCR, pozitif ve negatif bölümlerin sayısını sayarak standart eğrilere veya harici standartlara ihtiyaç duymadan hedef DNA'nın mutlak kantifikasyonuna olanak tanır. Dijital PCR, özellikle düşük bolluktaki hedefleri ve alışılmadık genetik olayları tespit etmek için faydalıdır.
Ters PCR
Ters PCR, bilinen yan dizileri olan ancak ortada bilinmeyen bir dizi bulunan DNA segmentlerini çoğaltmak için kullanılır. Yan bölümlere bağlanan ve dışarı doğru çoğalan primerler oluşturmayı gerektirir ve bu da aradaki bilinmeyen dizinin çoğaltılmasıyla sonuçlanır. Ters PCR, genomda yürümek, genleri klonlamak ve bilinmeyen DNA dizilerini keşfetmek için kullanılabilir.
ÖZET
PCR, bilim insanlarına belirli DNA dizilerinin çoğaltılması için güçlü bir araç sağlayarak moleküler biyolojiyi dönüştürdüAraştırmacılar, genetik test ve adli tıptan hastalık teşhisine ve DNA dizilemesine kadar PCR'de yer alan kavramları ve aşamaları anlayarak çok çeşitli uygulamaların kilidini açtılar. PCR'nin DNA'yı katlanarak çoğaltma kapasitesi, genetik araştırmaları değiştirdi ve bilim ve tıpta sayısız ilerlemenin yolunu açtı.
