Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) etkili ve hızlı bir analitik ayırma tekniği ve modern ayırma testinin önemli bir aracıdır. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi geniş bir uygulama yelpazesine ve numunelere geniş bir uygulanabilirlik yelpazesine sahiptir. Analitik nesnenin uçuculuğu ve termal kararlılığı ile sınırlı değildir. Yüksek kaynama noktalı, polar, iyonik bileşikler ve makro moleküler maddeler dahil olmak üzere hemen hemen tüm bileşikler yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile analiz edilebilir ve belirlenebilir. Bu nedenle, gaz kromatografisinin eksikliğini telafi edebilir. Bu makale yüksek performanslı sıvı kromatografisinin özelliklerini ve SSS'lerini tanıtacaktır.
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisinin Özellikleri
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, “üç yüksek, bir geniş ve bir hızlı":
- Yüksek basınç
Mobil faz sıvıdır. Kromatografik kolondan aktığında, aldığı direnç nispeten büyüktür. Kromatografik kolondan hızlı bir şekilde geçmek için, taşıyıcı sıvıya yüksek basınç uygulanmalıdır.
- Yüksek verim
HPLC kromatografisi yüksek ayırma verimliliğine sahiptir. Sabit ve hareketli fazlar optimum ayırma için seçilebilir, endüstriyel damıtma kolonlarından ve gaz kromatografisinden çok daha yüksek ayırma verimliliğine ulaşılabilir.
- Yüksek hassasiyet
UV dedektörü 0.01ng’ye kadar ulaşabilmekte olup, enjeksiyon hacmi μL mertebesindedir.
- Geniş uygulama alanı
Organik bileşiklerin %70'inden fazlası, özellikle yüksek kaynama noktasına sahip bileşiklerin, makro moleküllerin, güçlü polariteye ve zayıf termal kararlılığa sahip bileşiklerin ayrılması ve analizi, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile analiz edilebilir. Bunlar HPLC kromatografisinin avantajlarıdır.
- Hızlı analiz hızı ve hızlı taşıyıcı sıvı akış hızı
Klasik sıvı kromatografisinden çok daha hızlıdır, genellikle bir örneği 15 ila 30 dakikada analiz eder. Bazı örnekler 5 dakika içinde, genellikle 1 saatten daha kısa sürede bile tamamlanabilir.
Ek olarak, yüksek performanslı sıvı kromatografisi, kromatografik kolonun tekrar tekrar kullanılması, numuneye zarar gelmemesi ve kolay geri kazanım avantajlarına sahiptir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisinin dezavantajı, "ekstra kolon etkisi"dir. Enjeksiyondan dedektöre kadar kolon dışındaki herhangi bir ölü alanda (enjektör, kolon konektörü, bağlantı tüpü, tespit hücresi vb.) mobil fazın akış deseninde bir değişiklik varsa, herhangi bir difüzyon ve tutulma önemli pik genişlemesine ve kolon verimliliğinin azalmasına yol açabilir. HPLC dedektörleri, gaz kromatografisinden daha az hassastır.
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi Hakkında Sıkça Sorulan Sorular
İşte HPLC makinelerinde sık karşılaşılan 5 sorun.
- Girdap yayılımı
Mobil faz daha büyük katı parçacıklara çarparak taşa çarpan girdap benzeri akan su yaratır. Kolon paketlemesi düzensizse ve bazı parçalar gevşekse veya ince oluklar varsa, mobil fazın hızı hızlıdır. Bazı parçalar kümelenmiş veya sıkı bir şekilde paketlenmiştir ve akış yavaştır. Bu nedenle, katı faz taşıyıcısının parçacıkları küçük ve düzgün olmalı ve kolonun paketlemesi sıkı ve düzgün olmalıdır, böylece girdap akımı difüzyonu küçük ve kolon verimliliği yüksek olur.
- Moleküler difüzyon
Moleküler difüzyon, madde moleküllerinin yüksek konsantrasyonlu bir alandan düşük konsantrasyonlu bir alana hareketidir, buna uzunlamasına moleküler difüzyon da denir. Moleküler difüzyonu azaltmak için, kolonu doldurmak için küçük ve tekdüze katı faz parçacıkları kullanılır. Aynı zamanda, çalışma sırasında, akış hızı çok yavaşsa ve ayrılan maddeler uzun süre kalırsa, difüzyon ciddi olacaktır.
- Kütle Transferi
Ayrılacak maddeler, daha dar bir bölge oluşabilmesi için hareketli ve sabit fazlarda dengelenmelidir. Sıvı kromatografisinde, çözünen moleküllerin iki sıvı faz arasında bölünmesi veya katı bir faza adsorbe edilmesi ve desorbe edilmesi zaman alır. Akış hızı yüksek olduğunda, transfer hızı yavaştır ve denge dinamik fazına ulaşmadan önce ileri doğru hareket eder. Bu maddelerin denge dışı hareketi bölgeyi genişletir.
- Hareketli fazın akış hızı
Akış hızı çok düşük olduğunda, moleküler difüzyon şiddetlidir, özellikle gaz kromatografisinde. Teorik plaka yüksekliği akış hızına karşı çizilirse, teorik plaka yüksekliği akış hızındaki artışla birlikte hızla azalır. Akış hızı en düşük değere ulaştığında, kütle transferi önemli bir rol oynar ve teorik plaka yüksekliği tekrar artar. Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde, biraz daha hızlı bir akış hızının çok az etkisi vardır. Ancak jel filtrasyon kromatografisinde, maddenin jele nüfuz etmesi gerektiğinden, kütle transferi büyük bir etkiye sahiptir ve akış hızı kolon verimliliğini azaltacaktır.
- Sabit fazın parçacık boyutu
Fazlama parçacıkları ne kadar küçükse kolon verimi o kadar yüksek olur, hareketli fazın akışına karşı direnç o kadar büyük olur ve basıncı artırma ihtiyacı akmasını sağlayabilir.
