Floresan mikroskobu organik veya inorganik maddelerin özelliklerini incelemek için yansıma ve emilim yerine veya bunlara ek olarak floresans ve fosforesans kullanan bir tür optik mikroskoptur. Floresans, ışık veya diğer elektromanyetik radyasyonu emen maddelerden ışık emisyonudur, fosforesans ise floresansla ilişkili belirli bir fotolüminesans türüdür. Floresansın aksine, fosforesanslı bir malzeme emdiği radyasyonu hemen yeniden yaymaz. Floresans mikroskobu yirminci yüzyılın başlarında August Kohler, Karl Reichert ve Heinrich Lehmann tarafından icat edilmiştir.
Floresan Mikroskobunun Prensipleri
Hücresel bileşenlerin çoğu renksizdir ve mikroskop altında ayırt edilemez. Floresan mikroskobunun temel öncülü, parçaları boyalarla boyamaktır.
Floresan boyalar, floroforlar veya florokromlar olarak da bilinir, belirli bir dalga boyunda (genellikle UV) uyarım ışığını emen moleküllerdir. Kısa bir gecikmeden sonra, daha uzun dalga boyunda ışık yayılır. Emilim ve emisyon arasındaki gecikme ihmal edilebilir düzeydedir, genellikle nanosaniye mertebesindedir.
Daha sonra emisyon ışığı, uyarım ışığından filtrelenerek floroforun yeri ortaya çıkarılabilir.
Floresan mikroskopları numuneyi aydınlatmak için çok daha yüksek yoğunluklu ışık kullanır. Bu ışık numunedeki floresan maddeleri uyarır ve bunlar daha uzun dalga boylarında ışık yayar.
Elde edilen görüntü, numuneyi aydınlatmak ve uyarmak için kullanılan ışıktan ziyade, ikincil ışık kaynağının veya floroforun emisyon dalga boyuna dayanmaktadır.
Floresan Mikroskobu ile Çalışma
Uyarım dalga boyundaki ışık, objektif lens aracılığıyla numuneye odaklanır. Numune tarafından yayılan floresans, objektif lens aracılığıyla dedektöre odaklanır. Uyarım ışığının çoğu numuneden geçtiğinden, yayılan ışıkla birlikte yalnızca yansıyan uyarım ışığı objektife ulaşır.
Floresan mikroskopi görüntüleme yöntemi
"Floresan mikroskobu", görüntü oluşturmak için floresan kullanan tüm mikroskopları ifade eder; ister epifloresan mikroskobu gibi daha basit bir kurulum olsun, ister daha iyi çözünürlüklü Floresan görüntüsü için optik kesitleme kullanan konfokal mikroskop gibi daha karmaşık bir tasarım olsun.
Kullanılan floresan mikroskoplarının çoğu, floroforların uyarılması ve floresansın saptanmasının aynı optik yol (yani objektif mercek) üzerinden gerçekleştirildiği epifloresan mikroskoplardır.
Floresan mikroskobunun bileşenleri
bir floresan mikroskobu floresan boyalardan (floroforlar), bir ışık kaynağından, dikroik aynadan ve fırlatma filtresinden oluşur
Floresan boyalar (floroforlar)
Florofor, ışıkla uyarıldığında ışığı yeniden yayan floresan bir bileşiktir.
Floroforlar genellikle birden fazla aromatik grubun bir araya gelmesiyle oluşan veya çoklu π-bağları içeren düzlemsel veya halkasal moleküllerdir.
Birçok floresan boya, çeşitli biyomoleküller için tasarlanmıştır.
Bunlardan bazıları, doğası gereği floresan olan ve ilgi çekici biyomoleküllere bağlanan küçük moleküllerdir. Bunların başlıca örnekleri, DAPI ve Hoechst gibi nükleik asit boyaları ve memeli hücrelerindeki aktin liflerini boyamak için kullanılan faloidindir.
Bir ışık kaynağı
Işık kaynaklarında ksenon ark lambaları veya uyarım filtreli cıva buharlı lambalar, lazerler ve yüksek güçlü LED'ler olmak üzere dört ana tip ışık kaynağı kullanılmaktadır.
Lazerler çoğunlukla karmaşık floresan mikroskopi tekniklerinde kullanılırken, ksenon lambalar, cıva lambaları ve dikroik uyarım filtreli LED'ler geniş alan epi-floresan mikroskopisinde sıklıkla kullanılır.
Uyarım filtresi
Uyarıcılar genellikle sadece florofor tarafından emilen dalga boylarını geçiren bant geçiren filtrelerdir, böylece diğer floresan kaynaklarından gelen uyarımı en aza indirir ve floresan emisyon bandındaki uyarım ışığını engeller.
Dikroik ayna
Dikroik filtre veya ince film filtresi, küçük bir renk aralığındaki ışığı seçici olarak geçirirken diğer renkleri yansıtmak için kullanılan çok hassas bir renk filtresidir.
Başlatma filtresi
Yayıcı genellikle yalnızca florofor tarafından yayılan dalga boyunu geçiren ve bu bant dışındaki tüm istenmeyen ışığı, özellikle de uyarım ışığını engelleyen bir bant geçiş filtresidir.
Filtreler, istenmeyen uyarım enerjisini (UV ve IR dahil) veya numune ve sistem otofloresansını engelleyerek mümkün olan en karanlık arka planı sağlar.
Floresan Mikroskobisinin Uygulamaları
Sabit ve canlı biyolojik örneklerdeki yapıları tanımlayın.
Floresan mikroskopisi, çok renkli boyama, hücre içindeki yapıların etiketlenmesi ve hücrelerin fizyolojik durumunun ölçülmesine olanak sağlaması nedeniyle günümüzde yaşam bilimleri araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir araçtır.
Floresan Mikroskobun Avantajları
Canlı hücre görüntülemede sergilenen dinamik davranışları incelemek için en popüler yöntem floresan mikroskobudur.
Bu, floresan olmayan materyalin arasında yüksek derecede özgüllüğe sahip bireysel proteinleri izole etme yeteneğinden kaynaklanmaktadır.
Hassasiyet, mikrometre küp başına 50 molekül kadar azını tespit edebilecek kadar yüksektir.
Artık farklı moleküller farklı renklerle boyanabiliyor ve bu sayede birden fazla molekül türünün aynı anda izlenmesi mümkün oluyor.
Bu faktörler bir araya gelerek floresan mikroskobisine hem in vitro hem de in vivo görüntülemede diğer optik görüntüleme tekniklerine göre belirgin bir üstünlük kazandırmaktadır.
