A spektrofotometre, spektrometre olarak da bilinir, karmaşık ışığı spektral çizgilere ayrıştıran bilimsel bir araçtır. Spektrometrenin ölçüm aralığı genellikle 380 ila 780 nm dalga boyu aralığına sahip görünür ışık bölgesini ve 200 ila 380 nm dalga boyu aralığına sahip ultraviyole ışık bölgesini içerir. Farklı ışık kaynaklarının emisyon spektrumları vardır, bu nedenle farklı ışıklı gövdeler cihazın ışık kaynağı olarak kullanılabilir. Bir tungsten lambanın emisyon spektrumu: bir tungsten lamba tarafından yayılan 380-780 nm dalga boyundaki spektrum ışığı, kırmızı, turuncu, sarı, yeşil, mavi, lacivert ve mordan oluşan sürekli bir kromatogram elde etmek için bir prizma tarafından kırılır; bu kromatogram görünür ışık olarak kullanılabilir Spektrofotometrenin ışık kaynağı.
Spektrometrenin spektral aralığı
The spektrometre 400 ila 760 nm dalga boyu aralığına sahip görünür ışık bölgesini ve 200 ila 400 nm dalga boyu aralığına sahip ultraviyole ışık bölgesini içerir. Farklı ışık kaynaklarının emisyon spektrumları vardır, bu nedenle farklı ışıklı gövdeler cihazın ışık kaynağı olarak kullanılabilir.
Tungsten lambanın emisyon spektrumu: Tungsten lamba ışık kaynağı tarafından yayılan 400～760nm dalga boyundaki spektrum ışığı bir prizma tarafından kırılır ve kırmızı-turuncu, sarı-yeşil, mavi lacivert ve mordan oluşan sürekli bir kromatogram elde edilebilir; bu kromatogram görünür ışık spektrofotometresi ışık kaynağı olarak kullanılabilir.
Bir hidrojen lambasının (veya döteryum lambasının) emisyon spektrumu: Hidrojen lambası, bir ultraviyole fotometrenin ışık kaynağı olarak kullanılabilen, 185 ila 400 nm dalga boyunda bir spektrum yayabilir.
Maddenin emilim spektrumu
Belirli bir maddenin çözeltisi ışık kaynağı ile prizma arasına konulursa, bu sırada ekranda görüntülenen spektrum artık ışık kaynağının spektrumu olmaz ve birkaç koyu çizgi, yani ışık kaynağı emisyon spektrumunda belirli dalga boylarının ışık kaynağı belirir. Çözelti emer ve kaybolur. Bu spektrum çözelti tarafından emildikten sonra çözeltinin emilim spektrumu olarak adlandırılır. Farklı maddelerin emilim spektrumları farklıdır. Bu nedenle, emilim spektrumuna göre çözeltide bulunan maddeler tanımlanabilir.
Spektrometre kullanımı
Nükleik asit kantifikasyonu
Nükleik asit kantifikasyonu spektrofotometrenin en sık kullanılan fonksiyonudur. Spektrometre, oligonükleotidleri, tek sarmallı ve çift sarmallı DNA'yı ve tamponda çözünmüş RNA'yı kantifize edebilir. Nükleik asidin en yüksek emilim zirvesinin emilim dalga boyu 260 nm'dir. Her nükleik asidin moleküler bileşimi farklıdır, bu nedenle dönüşüm faktörü de farklıdır. Farklı nükleik asit tiplerini kantifize etmek için, karşılık gelen katsayılar önceden seçilmelidir. Örneğin, 1OD'nin absorbansı 50μg/ml dsDNA, 37μg/ml ssDNA, 40μg/ml RNA ve 30μg/ml Olig'e eşdeğerdir.
Testten sonra absorbans değeri, karşılık gelen örnek konsantrasyonunu elde etmek için yukarıdaki katsayı ile dönüştürülür. Testten önce doğru programı seçin, orijinal çözeltinin ve seyrelticinin hacmini girin ve ardından boş çözeltiyi ve örnek çözeltisini test edin. Ancak, deney tamamen sorunsuz ilerlemedi. Kararsız okumalar deneyciler için en büyük baş ağrısı olabilir. Cihazın hassasiyeti ne kadar yüksekse, absorbanstaki değişim o kadar büyük olur.
Proteinin doğrudan kantifikasyonu (UV yöntemi)
Bu yöntem, proteini doğrudan 280 nm dalga boyunda test etmek içindir. Warburg formülünü seçin, fotometre doğrudan numunenin konsantrasyonunu görüntüleyebilir veya absorbans değerini numune konsantrasyonuna dönüştürmek için karşılık gelen dönüştürme yöntemini seçebilirsiniz. Protein belirleme süreci çok basittir, önce boş çözeltiyi test edin ve ardından proteini doğrudan test edin. Tamponda bazı safsızlıklar olduğundan, genellikle 320 nm "arka plan" bilgisini ortadan kaldırmak ve bu işlevi "açık" olarak ayarlamak gerekir. Test nükleik asidine benzer şekilde, A280'in absorbans değerinin en az 0.1A'dan büyük olması gerekir ve en iyi doğrusal aralık 1.0-1.5 arasındadır. Doğrudan protein kantifikasyon yöntemi, daha saf ve nispeten tek bileşenli proteinleri test etmek için uygundur. Kolorimetrik yöntemle karşılaştırıldığında, ultraviyole doğrudan kantifikasyon yöntemi hızlı ve kullanımı kolaydır; ancak, DNA gibi paralel maddelerden kaynaklanan girişime karşı hassastır; ayrıca, düşük hassasiyete sahiptir ve daha yüksek protein konsantrasyonu gerektirir.
Bakteriyel hücre yoğunluğu (OD 600)
Laboratuvar, bakterilerin büyüme yoğunluğunu ve büyüme periyodunu belirlemek için bir spektrometre kullanabilir. OD600, sıvı kültürlerde mikroorganizmaların büyümesini izlemek için standart yöntemdir. Bakteri eklenmemiş kültür solüsyonunu boş solüsyon olarak kullanın ve ardından kültürden sonra bakteri içeren kültür solüsyonunu ölçün. Deneyde ara sıra bakteri solüsyonunun OD değeri negatif görünebilir. Bunun nedeni, renk geliştiren ortamın kullanılmasıdır, yani bakteriler bir süre kültürlendikten sonra ortamla reaksiyona girer ve bir renk değişimi reaksiyonuna neden olurlar. Ayrıca, test edilen numunelerin santrifüj edilemeyeceği ve bakterilerin süspansiyonda tutulması gerektiği unutulmamalıdır.
